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Jun 23, 2023

mRNA rilasciato per via intradermica

Nature Biomedical Engineering

Nature Biomedical Engineering (2023) Citare questo articolo

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Il successo delle terapie con RNA messaggero dipende in gran parte dalla disponibilità di sistemi di rilascio che consentano la traduzione sicura, efficace e stabile del materiale genetico in proteine ​​funzionali. Qui mostriamo che le vescicole extracellulari (EV) prodotte tramite nanoporazione cellulare da fibroblasti dermici umani e che incapsulano la codifica dell'mRNA per il collagene α1 di tipo I della matrice extracellulare (COL1A1) hanno indotto la formazione di innesti di proteine ​​di collagene e ridotto la formazione di rughe nel collagene- tessuto dermico impoverito di topi con pelle fotoinvecchiata. Mostriamo anche che la consegna intradermica degli EV caricati con mRNA tramite una matrice di microaghi ha portato alla sintesi e alla sostituzione prolungata e più uniforme del collagene nel derma degli animali. La somministrazione intradermica di mRNA COL1A1 basato su EV può costituire un'efficace terapia sostitutiva proteica per il trattamento della pelle fotoinvecchiata.

I recenti sviluppi nelle tecniche di modificazione dell’RNA messaggero hanno migliorato l’efficienza terapeutica del rilascio di mRNA e il suo potenziale per applicazioni cliniche a breve termine, tra cui la terapia sostitutiva proteica e la vaccinazione contro il virus della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1, 2. Tuttavia, l’incapacità intrinseca e la potenziale immunogenicità degli mRNA richiedono che essi siano incapsulati all’interno di veicoli di rilascio. Le attuali modalità di distribuzione dell'mRNA sono incentrate sull'uso di trasportatori di nanoparticelle lipidiche (LNP) per l'incapsulamento e il trasporto3,4. Tuttavia, gli LNP pongono diverse sfide importanti, tra cui citotossicità, scarsa biodistribuzione, mancanza di specificità del bersaglio e immunogenicità. Questi problemi possono essere causati dalla necessità di PEGilazione superficiale (PEG sta per poli(etilenglicole)) degli LNP per migliorarne l'emivita circolatoria e ridurre la clearance non specifica5,6. In particolare, la somministrazione di LNP nelle persone è stata collegata ad anafilassi, ipersensibilità ed eventi avversi autoimmuni7,8. Pertanto, l'identificazione di portatori di mRNA in grado di superare alcune di queste sfide associate all'LNP sarebbe utile per l'ulteriore sviluppo di terapie basate sull'mRNA.

Le vescicole extracellulari (EV), inclusi esosomi e microvescicole, svolgono un ruolo importante nel trasporto di biomolecole e acidi nucleici, inclusi mRNA, all'interno del corpo umano9,10,11. Di conseguenza, negli ultimi anni, i veicoli elettrici sono emersi come promettenti vettori per terapie basate sugli acidi nucleici grazie alla loro biocompatibilità intrinseca, alla loro capacità di attraversare barriere fisiologiche e alla loro bassa immunogenicità12,13. A differenza degli LNP, gli EV, compresi gli esosomi, sono prodotti endogenamente dalle cellule del corpo e portano a livelli più bassi di risposte infiammatorie. Inoltre, sono state sviluppate strategie per produrre facilmente e in modo economico grandi quantità di esosomi. In precedenza abbiamo segnalato un metodo di nanoporazione cellulare (CNP) in cui sono stati creati pori nanometrici transitori sulla superficie delle cellule sorgente per consentire il caricamento su larga scala di mRNA a trascrizione completa in EV secreti14. Qui, utilizzando un modello murino di fotoinvecchiamento acuto che imita da vicino le caratteristiche fisiopatologiche della pelle danneggiata dall'invecchiamento negli esseri umani15, mostriamo l'utilità della terapia con mRNA COL1A1 basata su esosomi per sostituire la perdita di proteine ​​di collagene dermico come trattamento antietà per fotoinvecchiamento pelle. Per migliorare l'efficienza del rilascio e della ritenzione dell'mRNA, mostriamo anche che il rilascio dell'mRNA del collagene tramite un cerotto con microaghi di acido ialuronico (HA) (COL1A1-EV MN) consente una distribuzione più efficiente dell'mRNA nel derma, con conseguente collagene durevole -attecchimento proteico e nel miglioramento del trattamento delle rughe nella pelle fotoinvecchiata.

L'atrofia cutanea dovuta alla perdita irreversibile di collagene è un segno distintivo dell'invecchiamento cutaneo16,17. Numerosi metodi hanno mirato a ripristinare la perdita di proteine ​​di collagene nella pelle, spaziando dagli approcci farmaceutici e da banco (antiossidanti18,19,20, retinoidi21, peptidi22,23) ai dispositivi medici (ovvero terapia laser24 e filler dermici sintetici25,26) . Tuttavia, nessuna di queste tecnologie esistenti è stata in grado di ottenere una sostituzione del collagene endogeno a lungo termine per mantenere la forza, la compattezza e l’elasticità della pelle nel tempo27,28,29. Anche la stimolazione dei fibroblasti responsabili della sintesi delle proteine ​​del collagene può rappresentare un metodo efficace per il controllo a breve termine dell’invecchiamento cutaneo30. Tuttavia, man mano che invecchiano, i fibroblasti perdono gradualmente la loro capacità di proliferare e sintetizzare il collagene, rendendo difficile l'uso di metodi a lungo termine di sostituzione del collagene per il trattamento antietà31. Per superare queste limitazioni, abbiamo mirato a sostituire la proteina del collagene in un modello di deplezione del collagene dovuto al fotoinvecchiamento tramite la consegna di mRNA mediata da EV. Per generare EV caricati con mRNA di collagene I alfa I umano (COL1A1), abbiamo impiegato una tecnica CNP che prevedeva la placcatura di un monostrato di fibroblasti dermici umani neonatali (nHDF) su una superficie di nanopori e la nanotrasfezione delle cellule con un plasmide COL1A1-GFP ( Fig. 1a e Figura 1a supplementare)14. Gli EV sono stati isolati dai terreni di coltura il giorno dopo la trasfezione. È stato scoperto che le cellule trattate con CNP hanno un numero EV per cellula 10 volte più elevato rispetto alle cellule trattate con elettroporazione di massa standard (BEP), che è stata eseguita utilizzando elettrodi paralleli in stile cuvetta come precedentemente descritto32, o nHDF non trattati in coltura (Fig .1b). Gli EV prodotti da ciascun metodo erano caratterizzati da una distribuzione dimensionale con un picco di circa 150 nm di diametro come determinato dall'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) e dall'80% dell'intensità nel picco della modalità mediante diffusione dinamica della luce (DLS) (Fig. 1c e Supplementare Fig. 1b,c) con un indice di polidispersità (PDI) di 0,12–0,25. Esperimenti Western blot hanno mostrato che le espressioni dei biomarcatori dell'esosoma (CD9, CD63, TSG101) e della microvescicola (ARF6) nel gruppo trattato con CNP erano significativamente più alte rispetto al gruppo non trattato, confermando l'aumento degli EV secreti (Figura 1d supplementare). Le analisi cinetiche hanno inoltre mostrato che il rilascio di EV ottimizzato per la tensione ha raggiunto il picco a 8 ore dopo l'induzione del CNP, con una secrezione continuata osservata nelle successive 24 ore (Figura 1e, f supplementare). La reazione a catena della polimerasi quantitativa con trascrizione inversa (RT-qPCR) ha mostrato che gli EV secreti da CNP contenevano più di 200 volte l'mRNA COL1A1 rispetto agli EV secreti da BEP e l'mRNA COL1A1 3.000 volte più alto rispetto agli EV secreti da cellule non trasfettate (Fig. 1d ). La valutazione del bioanalizzatore del gel di agarosio ha dimostrato l'mRNA COL1A1 trascritto a lunghezza intera a ~ 4.000 nucleotidi (Fig. 1e). Gli EV preparati dal CNP hanno mostrato stabilità strutturale se conservati per la somministrazione preclinica a 4 ° C senza cambiamenti nell'aspetto, nelle proprietà della membrana e delle dimensioni quando valutati mediante microscopia crioelettronica (cryo-EM), microscopia a forza atomica (AFM) e NTA (Figura complementare .2a–c). Inoltre, l'mRNA COL1A1 incapsulato all'interno degli EV era stabile sia a temperatura ambiente che a 4 ° C e mostrava anche stabilità sierica, evidenziando così il loro potenziale per la futura utilità clinica (Figura 2d, e supplementare).